分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及**生長濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。

分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比，其關系如下式:

A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc

式中 :A 為吸光度;

I。為入射的單色光強度;

I 為透射的單色光強度;

T 為物質(zhì)的透射率;

k 為摩爾吸收系數(shù);

L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長;

c 為物質(zhì)的濃度;

獨特的雙光路、雙光束光學系統(tǒng)，儀器分辨率更高，雜散光更低，穩(wěn)定性、可靠性更強，分析更加準確

采用320*240位點陣式高亮6 "液晶顯示器，顯示清晰，信息完備

獨特的長光程光路設計，使儀器分辨率更高，尤其適合微量測試 強大的數(shù)據(jù)處理功能，使測試結(jié)果能得到充分的應用，用戶編輯更為簡單快捷

采用懸架式光學系統(tǒng)設計，整體光路獨立固定在16mm厚的鋁制無變形基座上，底板的變形和外界的震動對光學系統(tǒng)不產(chǎn)生任何影響，從而大大提高了儀器的穩(wěn)定性和可靠性

采用同步正弦機構(gòu)，波長準確度高，重復性好

采用ARM系統(tǒng)

0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0六檔光譜帶寬自動可選,滿足不同用戶的測量需求

24位高速、高精度A/D轉(zhuǎn)換，儀器精度更高、反應速度更快

主要元件采用進口配置，使儀器雜散光更低、穩(wěn)定性、可靠性更強

功能更加強大，主機可獨立完成光度測量、定量測量、光譜掃描、動力學、DNA/蛋白質(zhì)測試，多波長測試及數(shù)據(jù)打印等功能

充分考慮不同用戶的使用習慣，本系列儀器都標配元析公司光譜掃描軟件，聯(lián)機操作時，除能實現(xiàn)主機的所有測試功能外，還可實現(xiàn)更為強大的數(shù)據(jù)處理功能，并且使數(shù)據(jù)存儲達到無限

■儀器指標

型號UV-9000波長范圍190-900nm光譜帶寬0.1/0.2/0.5/1.0/2.0/4.0nm六檔可選波長準確度±0.1nm(D2 656.1nm)， ±0.3nm全區(qū)域波長重復性≤0.1nm

光度準確度

±0.2%T光度重復性≤0.1%T雜散光≤0.01%T穩(wěn)定性±0.0004A/h(500nm處)基線平直度

±0.001A

噪聲水平 ±0.0004A/h光度范圍0-200%T、-4.0-4.0A、0-9999C數(shù)據(jù)輸出USB接口光學系統(tǒng)雙光束、原裝進口光柵顯示系統(tǒng)320*240位高亮6"大屏幕LCD光源進口長壽命鎢燈、氘燈檢測器原裝進口檢測器外形尺寸635*440*210mm電源

AC 220V/50Hz或110V/60Hz

重量30kg技術(shù)參數(shù)

波長范圍:320∽1000nm

光譜帶寬:4nm

雜散光:≤0.5%(在360nm處)

波長準確度:優(yōu)于±2nm

透射比準確度:≤±1nmT

常見用途

核酸的定量

核酸的定量是分光光度計使用頻率*高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的*高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如:1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者***的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準確度和**度。如Eppendorf Biophotometer的準確度≤1.0%(1A)。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等:在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數(shù)漂移如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了*大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值*好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的*小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

1.接通電源，打開儀器開關，掀開樣品室暗箱蓋，預熱10分鐘。

2.將靈敏度開關調(diào)至"1"檔(若零點調(diào)節(jié)器調(diào)不到"0"時，需選用較**。)

3.根據(jù)所需波長轉(zhuǎn)動波長選擇鈕。

4.將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對準光路。

5.在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤指針指向t=0處。

6.蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)"100"調(diào)節(jié)器，使空白管的t=100，指針穩(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測定管的光密度值，并記錄。

7.比色完畢，關上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。

注意事項

1.該儀器應放在干燥的房間內(nèi)，使用時放置在堅固平穩(wěn)的工作臺上，室內(nèi)照明不宜太強。熱天時不能用電扇直接向儀器吹風，防止燈泡燈絲發(fā)亮不穩(wěn)定。

2.使用本儀器前，使用者應該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理，以及各個操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前，應該對儀器的**性能進行檢查，電源接線應牢固，通電也要良好，各個調(diào)節(jié)旋鈕的起始位置應該正確，然后再按通電源開關。

3.在儀器尚未接通電源時，電表指針必須于"0"刻線上，若不是這種情況，則可以用電表上的校正螺絲進行調(diào)節(jié)。

日常維護

分析儀器工作者要懂得儀器的日常維護和對主要技術(shù)指標的簡易測試方法，自己經(jīng)常對儀器進行維護和測試，以保證儀器工作在*佳狀態(tài)。

一、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素。他們可以引起機械部件的銹蝕，使金屬鏡面的光潔度下降，引起儀器機械部分的誤差或性能下降;造成光學部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕，產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等，甚至儀器停止工作，從而影響儀器壽命。維護保養(yǎng)時應定期加以校正。應具備四季恒濕的儀器室，配置恒溫設備，特別是地處南方地區(qū)的實驗室。

二、環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體亦可以影響機械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關、按鍵、光電偶合器的可靠性，也是造成必須學部件鋁膜銹蝕的原因之一。因此必須定期清潔，保障環(huán)境和儀器室內(nèi)衛(wèi)生條件，防塵。

三、儀器使用一定周期后，內(nèi)部會積累一定量的塵埃，*好由維修工程師或在工程師指導下定期開啟儀器外罩對內(nèi)部進行除塵工作，同時將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固，對光學盒的密封窗口進行清潔，必要時對光路進行校準，對機械部分進行清潔和必要的潤滑，*后，恢復原狀，再進行一些必要的檢測、調(diào)校與記錄。

1)若大幅度改變測試波長，需稍等片刻，等燈熱平衡后，重新校正"0"和"100%"點。然后再測量。

2)指針式儀器在未接通電源時，電表的指針必須位于零刻度上。若不是這種情況，需進行機械調(diào)零。

3)比色皿使用完畢后，請立即用蒸餾水沖洗干凈，并用干凈柔軟的紗布將水跡擦去，以防止表面光潔度被破壞，影響比色皿的透光率。

4)操作人員不應輕易動燈泡及反光鏡燈，以免影響光效率。

5)1900型等分光光度計，由于其光電接收裝置為光電倍增管，它本身的特點是放大倍數(shù)大，因而可以用于檢測微弱光電信號，而不能用來檢測強光。否則容易產(chǎn)生信號漂移，靈敏度下降。針對其上述特點，在維修、使用此類儀器時應注意不讓光電倍增管長時間暴露于光下，因此在預熱時，應打開比色皿蓋或使用擋光桿，避免長時間照射使其性能漂移而導致工作不穩(wěn)。

6)放大器靈敏度換擋后，必須重新調(diào)零。

7)比色杯的配套性問題。比色杯必須配套使用，否則將使測試結(jié)果失去意義。在進行每次測試前均應進行比較。具體方法如下;分別向被測的兩只杯子里注入同樣的溶液，把儀器置于某一波長處，石英比色杯;220nm、700nm裝蒸餾水，玻璃比色杯:700nm處裝蒸餾水，將某一個池的透射比值調(diào)至100%，測量其他各池的透射比值，記錄其示值之差及通光方向，如透射比之差在±0.5%的范圍內(nèi)則可以配套使用，若超出此范圍應考慮其對測試結(jié)果的影響。

分光光度計分操作中容易出現(xiàn)的幾個典型故障及其排除方法:

1)儀器不能調(diào)零?？赡茉?

a)光門不能完全關閉。解決方法:修復光門部件，使其完全關閉。

b)透過率"100%"旋到底了。解決方法:重新調(diào)整"100%"旋鈕。

c)儀器嚴重受潮。解決方法:可打開光電管暗盒，用電吹風吹上一會兒使其干燥，并更換干燥劑。

d)電路故障。解決方法:送修理部門，檢修電路。

2)儀器不能調(diào)"100%"?？赡茉?

a)光能量不夠。解決方法:增加靈敏度倍率檔位，或更換光源燈(盡管燈還亮)。

b)比色皿架未落位。解決方法:調(diào)整比色皿架使其落位。

c)光電轉(zhuǎn)換部分老化。解決方法:更換部件。

d)電路故障。解決方法:調(diào)修電路。

3) 測量過程中,"100%"點經(jīng)常變動。可能原因:

a)比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴。解決方法:用擦鏡紙擦干凈比色皿表面，然后將其安放在比色槽的左邊，上面用定位夾定位。

b)電路故障(電壓、光電接收、放大電路)。解決方法:送修。

4)數(shù)顯不穩(wěn)?？赡茉?

a)預熱時間不夠。解決方法:延長預熱時間至30分鐘左右(部分儀器由于老化等原因，長時間處于工作狀態(tài)時，也會工作不穩(wěn))。

b)光電管內(nèi)的干燥劑失效，使微電流放大器受潮。解決方法:烘烤電路，并更換或烘烤干燥劑。

c)環(huán)境振動過大、光源附近空氣流速大、外界強光照射等。解決方法:改善工作環(huán)境。

d)光電管、電路等其它原因。解決方法:送修。

五、提高分光光度計透射比檢定及使用精度的幾種方法

在分光光度計的使用或檢定中,透射比(吸光度)的準確度是衡量儀器工作性能的一項重要指標,它的準確程度直接關系到所測數(shù)據(jù)的可信性及科學性。所以提高此項指標的使用及檢定準確度顯得尤為重要。